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摘自《中國沼氣》第6期 趙宇莎 鄭丹 于琪 茍敬 湯岳琴

沼氣工程沼氣池厭氧消化能有效地促進(jìn)能源與環(huán)境的協(xié)調發(fā)  展,一直備受關(guān)注。該過(guò)程通常需要不同微生物群  落(發(fā)酵細菌,產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌)的參與協(xié)  作,才能實(shí)現甲烷的生產(chǎn)。研究證實(shí),有更多功  能與特性未知的未培養微生物參與了沼氣工程沼氣池厭氧消化過(guò)  程,產(chǎn)甲烷機制比預期的更加復雜2。因此,鑒定  沼氣工程沼氣池厭氧消化體系中的微生物多樣性,有助于深入理解  產(chǎn)甲烷機制并指導工藝優(yōu)化調控。宏基因組學(xué)是近  20年新興的科學(xué)領(lǐng)域,它避開(kāi)微生物的分離培養過(guò)

程,直接從基因層面原位研究微生物的多樣性,可最大限度地識別環(huán)境微生物的群落信息?；诤昊蚪M的分子生物學(xué)技術(shù)(如DGGE,16sRNA基因克隆文庫,T-RFLP等)的發(fā)展,已經(jīng)成為分析沼氣工程沼氣池厭氧消化過(guò)程優(yōu)勢微生物的重要平臺。但這些傳統方法鑒定到的優(yōu)勢菌群往往并非是“真正”的功能微生物。

DNA穩定同位素探針( DNA stable- Isotope pro-bing,DNA-SP)是一種新興的分子生態(tài)學(xué)技術(shù),可

用于甄別復雜環(huán)境中參與特殊代謝功能的微生物。  其基本原理為:環(huán)境樣品經(jīng)穩定同位素標記的底物  (以C為主)培養后,微生物利用“C底物生長(cháng)繁殖  合成"CDNA,通過(guò)浮力密度差異將”CDNA與”C  DNA分離,進(jìn)一步對CDNA進(jìn)行分析即可獲得功  能微生物的信息。由于 DNA-SIP僅以來(lái)源于底物  利用菌的CDNA為研究對象,因此極大地降低了  環(huán)境微生物群落的復雜性,從而將底物代謝過(guò)程與  微生物群落組成直接相聯(lián)系3。鑒于 DNA-SIH技  術(shù)的優(yōu)勢,現已被應用于不同環(huán)境中各類(lèi)微生物功  能菌的鑒定(如甲基互營(yíng),生物降解,碳氮循環(huán)等過(guò)  程),但其在沼氣工程沼氣池厭氧消化過(guò)程中的應用相對較少6  此外, DNA-SIP存在CDNA回收量小、時(shí)間

長(cháng)、容易交叉標記等缺陷,因此,探索合適的標記及  離心條件并獲得足夠的CDNA是成功富集功能微

生物的關(guān)鍵。本研究以”C葡萄糖為底物,考察

了不同條件對沼氣工程沼氣池厭氧消化污泥中葡萄糖利用菌的標記  效果旨在為鑒定真正的沼氣工程沼氣池厭氧消化功能群提供基礎,

進(jìn)而促進(jìn)對沼氣工程沼氣池厭氧產(chǎn)甲烷機制的理解。

材料與方法

1.I污泥來(lái)源

用于穩定同位素標記的污泥來(lái)自本實(shí)驗的纖維

素沼氣工程沼氣池厭氧消化反應器。該完全混合型反應器總體積3L

工作體積2L,纖維素進(jìn)料負荷為1gLd-1,在53℃

低速攪拌(85mm)條件下連續穩定運行212d。

1.2試劑

主要試劑如”C葡萄糖(C,99%),CsCl,CTAB購于 sIgma公司(美國)

1.3污泥樣品的標記及分析

1.3.1標記樣品的培養及采樣

取30mL沼氣工程沼氣池厭氧消化污泥于50mL沼氣工程沼氣池厭氧瓶中,通

氮氣置換空氣后,立即采用丁基膠塞和鋁蓋密封并放置于搖床中餓養至污泥停止產(chǎn)氣。隨后將葡萄糖溶于滅菌水后采用無(wú)菌注射器投入沼氣工程沼氣池厭氧瓶,同時(shí)補充少量微量元素溶液,于53℃和150mpm條件下培養并取樣分析。底物添加及取樣操作均在沼氣工程沼氣池厭氧手套箱( Gene Science AG30,美國)中進(jìn)行。所有處理均設置兩個(gè)平行樣,并分別以C葡萄糖作為對照。其中,使用的微量元素溶液組分如下(gL)FeCl3·6H2O,1.35;MnCl2·4H2O,0.1;CaC2·2H,0,0.1;ZnC2,0.1;CuO2H20,0.025;H3BO3,0  01;Na2MO4·2H20,0.024;NaCl,1.O;Na2SeO3·5

H2O,0.026;次氮基三乙酸(NTA),12.8  1.3.2標記過(guò)程的氣體和樣品收集

定期采用10mL無(wú)菌注射器測定產(chǎn)氣量  品樣定期取樣后,于12000pm,4℃離心10min后

污泥沉淀和適量體積PBS緩沖溶液混合震蕩,于

12000m,4℃離心10min,反復清洗2-3次后,去除上清液,污泥沉淀保存于-80℃,用于后續的PCR1.3.3超高速密度梯度離心分離

利用常規CTAB法提取污泥的總DNA。取

Hg DNA,與4.8 mL CsCl溶液,1.2 mL Grader

er(GB緩沖液)混勻,采用10m無(wú)菌注射器將混合液移至6ml超高速離心管中,于超高速離心機( Beckman Coulter, OptimaI.80XP,美國)離心形成浮力密度梯度區帶。離心后使用軟管連接精密注射泵( Harvard Apparatus Pump Il Pico Plus,美國)與離心管,利用無(wú)菌水的水壓收集各層樣品,并采用折光儀( Reichert AR200,美國)測定各層級折光率。折光率與密度的換算公式如下:

n=0.07969+1.2649

式中:n為液體折光率;p為液體密度,gmL

1.3.4熒光定量PCR分析

對各層樣品的16 SrNA基因含量(拷貝數)進(jìn)行熒光定量PCR分析。反應體系總體積為20μl包括:10uM引物Eu518F及Eu27F各0.8ul,SYBR染液10山1,DNA2.0,滅菌水6.4ul。PCR反應  條件如下:95℃,預變性308;95℃,變性10s,50℃退火5s,72℃,延伸40s,共40個(gè)循環(huán);融解95℃10s,65℃60s,97℃1s;冷卻37℃30s。以16sTDNA基因的豐度(每層拷貝數與各層級拷貝數總和的比值)為縱坐標,浮力密度為橫坐標,可得16mDNA基因在不同浮力密度中的分布規律圖。

1.4DNA-SP標記條件的優(yōu)化

1.4.1離心轉速對DNA-SIP標記效果的影響

取底物投加量為30mg葡萄糖,標記時(shí)間為4天的樣品,分別在45400mpm和50300mm的轉速下于20℃離心40h,考察超高速離心轉速對標記效果的影響

1.4.2底物投加量對 DNA-SIP標記效果的影響

分別投加總量為30mg和60mg的葡萄糖,考察底物投機量對標記效果的影響。30mg葡萄糖次性投加,停止產(chǎn)氣時(shí)(4d)取樣。60mg葡萄糖于  第0和6天分別投加30mg,取樣時(shí)間為第11天

143若平消它每DP標定效果的響

10mn。利用上清液稀釋使得污泥固含量分別為  a1%,0.2%,0.4%,2.1%(w/w)。分批投加總量  為100mg的葡萄糖進(jìn)行標記培養,即于第0,4和8  天分別投加333mg,取樣時(shí)間為第8和12天(取  樣時(shí)底物投加總量分別為660m和100mg)。樣  品經(jīng)20℃,45400m,40h超離速離心分層后,考察  污泥固含量對標記效果的影響。

結果

離心條件優(yōu)化

實(shí)驗室前期小試發(fā)現:經(jīng)C葡萄糖標記的污泥中的CDNA與CDNA的浮力密度分別為1.70

及1.72-1.74gmL左右(數據未顯示)。因此,本研究考察了文獻報道常用的兩個(gè)離心轉速(50300mm和45400mpm)對污泥樣品的 DNA-SIP  標記效果。表1顯示:不同轉速下形成的CC介質(zhì)  中相鄰梯度區帶的浮力密度差有較大差異。由表1  可知轉速為45400mpm形成的浮力密度差較小。為  確保兩種DNA離心后相隔一個(gè)區帶,能被有效分  離,故后續離心條件設為20℃,45400mpm,40h  表1不同轉速條件下微生物DNA的分離效果(gmL

2.2底物投加量?jì)?yōu)化

分別向污泥中投加總量為30mg和60mg的葡萄糖,產(chǎn)氣量如圖1所示。由圖可知:所有樣品的產(chǎn)氣量均在第1天迅速升高,微生物每消耗完30mg葡萄糖大約需4~6d,隨后逐漸停止產(chǎn)氣。且C

葡萄糖與C葡萄糖的產(chǎn)氣趨勢及產(chǎn)氣量基本吻合,可作為對照進(jìn)行后續實(shí)驗。同時(shí),根據產(chǎn)氣結果,將30mg和60mg葡萄糖標記樣品的取樣時(shí)間分別設置為第4天和第11天。

標記后的污泥樣品經(jīng)超高速離心分層以后,利  用定量PCR檢測每層的16 S rDNA基因含量。獲得  16 S rDNA基因豐度在不同浮力密度中的分布規律,  如圖3和圖4所示。由圖可知,在輕密度層1.69~  1.71gmL的范圍內,所有樣品均出現最高豐度,  這表明污泥樣品CDNA在1.70gm-左右的密度  層被富集。在重密度層1.72~1.74gmL的范圍  內,投加有30mgC-葡萄糖的污泥樣品僅檢測到  較低的16 S rdNA基因拷貝數,表明該條件下C  DNA富集程度不高。投加有60mg"C-葡萄糖的樣  品CDNA豐度明顯提高,兩個(gè)平行樣品的豐度分  別達到了10.41%和6.05%,而C葡萄糖對照樣品  中的豐度僅為1.0%,這表明60mg的C-葡萄糖可  以富集到更多的CDNA,功能菌能被有效標記。  但圖3和圖4也顯示,在1.72~1.74g·mL前后的  密度層中也能檢測到一定數量的CDNA。因此,為了  為提高重密度層中CDNA的豐度,減少非目標微生

2.3污泥固含量?jì)?yōu)化

污泥固含量對 DNA-SIP標記效果的影響如圖5~  圖8所示。由圖可知:在1.72-1.74gmL的密度范  圍內,污泥固含量為0.1%,0.2%和0.4%(w/w)的所  有樣品的CDNA拷貝數明顯高于2.1%的樣品。  當底物投加量為66.6mg時(shí)(標記8天的樣  品),C-DNA主要存在于1.72gmL左右的密度層,且不同污泥固含量樣品的"CDNA豐度差異較大。污泥固含量為0.1%,0.2%,0.4%和2.1%(w/w)的樣品中,C-DNA豐度分別約為16.3%10%,10%和8.2%。這表示在該底物濃度下污泥固含量越低,C-DNA富集程度越高。而在更“重”的密度層1.74g·mL附近,各污泥固含量的CDNA豐度均低于5%。

當底物投加量為100mg時(shí)(標記12d的樣品),與第8天的標記樣品相比,所有污泥樣品在72-1.74g·mL密度層的CDNA豐度均有明顯提升。尤其在1.74g·mL的密度層,除污泥固含量為2.1%的樣品外,其它樣品的CDNA豐度均從第8天的低于5%提升至15%左右。上述結果

表明:當底物投加量從66.6mg增至100mg時(shí),可  有效提高CDNA在重密度層的豐度,顯示出更好  的標記效果。此外2.1%固含量的污泥樣品中的CDNA拷貝數在1.72-1.74gmL密度層仍然最低,表明即使投加更高濃度的底物,相對較低的污泥固含量仍更有利于CDNA的富集。但在污泥固含量為0.4%,0.2%,0.1%的樣品中,CDNA在1.74gmL密度層的豐度并未隨著(zhù)污泥固含量的減少而增大(分別為16.3%,14.2%和14%)。這可能是底物投加量已超過(guò)污泥中微生物的代謝水

平,大部分功能微生物已被標記,若繼續增加底物投  加量難以提高樣品的標記效果。

討論

DNA-SIH具有鑒定不同環(huán)境中“真正”功能微  物的優(yōu)勢。合適的標記及離心條件可以避免底物  二級利用,確保DNA的標記及富集效果,是決定  該技術(shù)成功的關(guān)鍵。但標記效果受到多因素的影  響:如環(huán)境樣品性質(zhì)、微生物種類(lèi)、底物結構、標記時(shí)  間離心轉速及時(shí)間等, DNA-SIP的培養條件及離心  條件難以標準化。鑒于利用 DNA-SIP識別沼氣工程沼氣池厭氧  消化功能微生物的研究相對較少,本研究考察了不  同條件(離心轉速、底物投加量和污泥固含量)對厭  氧污泥中葡萄糖利用菌的標記效果的影響。  利用超高速密度梯度離心技術(shù)可有效地將環(huán)境  總DNA中的CDNA與CDNA有效分離。本研  究發(fā)現45400mm的轉速比50300mpm有更好的CDNA富集效果。據報道,DNA在CaC1介質(zhì)中的浮力密度與微生物的GC含量成正比”。但無(wú)論哪種轉速條件,重浮力密度層仍然同時(shí)含有2CDNA與CDNA。 Lueders8等發(fā)現,即使采用純菌的CDNA進(jìn)行超高速離心,重密度層中仍能檢測到0.7%的CDNA。因此,這說(shuō)明目標微生物很難00%被標記, DNA-SIF實(shí)驗必須設計C底物的對照樣品。

研究表明,當 C-DNA豐度接近20%時(shí),更容  易從環(huán)境樣品總DNA中分離出"CDNA。而C  DNA的生成伴隨著(zhù)微生物細胞對底物的同化利用,  這表明CDNA豐度與底物投加量和微生物種群數  量(本文為污泥固含量)存在直接聯(lián)系。底物投加  量?jì)?yōu)化結果顯示:在1.2-1.74g·mL-的密度范

圍內,投加30mg1C-葡萄糖的污泥樣品的C.DNA

豐度較低。目前尚無(wú)標準方法來(lái)確定底物投加量

但底物濃度過(guò)低難以標記到目標微生物,因為僅有

1/3的底物被微生物用于合成自身物質(zhì)。此外,加入體系的底物被微生物同化之前會(huì )有一個(gè)稀釋過(guò)

程,這使得微生物會(huì )暫時(shí)利用其他碳源或中間代謝產(chǎn)物,這一特性降低了C-DNA的比例,進(jìn)一步增加了計算底物投加量的難度°。雖然分批投加60mgC-葡萄糖可以將C-DNA豐度提高到10.41%,但仍含有較多的非目標微生物。因此,在后續考察污泥固含量的研究中,將"C-葡萄糖投加量提高到了100mg,此時(shí)污泥中C-DNA豐度最高可達16.3%。上述結果表明,高的底物投加量有助于提高CDNA豐度。但底物投加量過(guò)高,一方面會(huì )增加DNA-SIP的成本;另一方面會(huì )使樣品脫離原始狀態(tài)群落代謝過(guò)程受到影響,產(chǎn)生微生物富集偏差,不符合 DNA-SIP原位鑒定的宗旨。因此,在滿(mǎn)足CDNA的標記效果及分離效果的基礎上,采用最少的C底物是理想的培養實(shí)驗。污泥固含量研究結果顯示:當底物濃度一定時(shí)(不高于污泥最高代謝水平),污泥固含量越低,C-DNA富集程度越高。該結果進(jìn)一步證實(shí)底物量與微生物種群數量需要有合適的比例,才能獲得最高的標記CDNA。不同研究報道中的微生物菌群生態(tài)位、生理代謝差異極大,因此,非常有必要對這兩個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化

4結論

選擇合適的標記及離心條件以獲得足夠的C  DNA,是利用 DNA-SIR技術(shù)成功富集功能微生物的關(guān)鍵。本研究以C葡萄糖為底物,選取離心轉速,底物投加量和污泥固含量3個(gè)重要因素,考察了它  們對沼氣工程沼氣池厭氧消化污泥中葡萄糖利用菌的 DNA-SIP標記效果的影響。結果顯示,相對低的轉速、高底物投  加量及低污泥固含量可以獲得較高的CDNA豐  度。但底物量不能一味增加,需同時(shí)考慮微生物的  代謝水平、與環(huán)境條件的一致性等因素,在盡量減少